Potencjalne zastosowania terapeutyczne edycji genów systemem CRISPR-Cas9

Coraz częściej w fachowej literaturze biotechnologicznej pojawia się enigmatyczny akronim „CRISPR”. Najnowsze doniesienia bardzo entuzjastycznie opisują kolejne zastosowania rewolucyjnej metody edycji DNA, opartej o białko Cas9 i pewne nietypowe sekwencje palindromowe, szerzej znane właśnie jako „CRISPR”. Na czym polega owa metoda i jaki jest potencjał dla medycyny?

Kilka słów o edycji genów

Koncepcja edycji genów jest prawie tak stara, jak zdrowie reakcja PCR. Celowe wprowadzanie konkretnych zmian sekwencji nukleotydowej służyło zdrowie początkowo naukom podstawowym – eksperymentowano na hodowlach zdrowie bakteryjnych przy wykorzystaniu zmienionych ex vivo wektorów plazmidowych i/lub bakteriofagów. Taka forma edycji genów nosiła miano ukierunkowanej mutagenezy (ang. site-directed mutagenesis) i została opisana w 1975 roku [1]. Wprowadzanie zmian było przez dziesięciolecia procesem żmudnym i mało wydajnym. Dynamiczny rozwój technik zdrowie edycji genów nastąpił w ciągu ostatnich 5 lat, wraz z opracowaniem technologii edycji przy pomocy „talenów” (TALn) [2], a następnie systemu CRISPR.
System CRISPR-Cas9: wydajny i dokładny sposób wprowadzania zmian w sekwencji nukleotydowej
Akronim CRISPR oznacza w wolnym tłumaczeniu “regularnie zgrupowane, oddzielone, krótkie sekwencje palindromowi” (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Rozwinięcie skrótu dobrze opisuje naturę tych fragmentów DNA – zostały one scharakteryzowane u E. coli a następnie u innych bakterii i ze względu na wyjątkową budowę i zakonserwowany charakter zwróciły uwagę badaczy. Ich funkcja okazała się zdrowie ciekawa i budziła skojarzenia z interferencją zdrowie RNA u eukariotów- jest to podobnie jak RNAi element „komórkowego układu immunologicznego”. Broni on gospodarza przed obcym, wirusowym materiałem  zdrowie genetycznym, niszcząc go przy współudziale enzymów nukleolitycznych Cas (najbardziej użyteczna dla nauki dla okazała się być nukleaza Cas9).
Najważniejszymi cechami systemu CRISPR-Cas9, które czynią go wyjątkowym narzędziem dla biologii molekularnej, są:
-Programowalność
-Łatwość ich zastosowania in vitro
-Wysoka specyficzność
-Duża wydajność transformacji
-Brak homologii z genami komórek eukariotycznych
-Możliwość zastosowania wielu celów w jednym eksperymencie

„Programowalność” sprawia, że odpowiednio zaprojektowany CRISPR potrafi rozpoznać niemalże dowolny fragment DNA i doprowadzić do jego przecięcia.

Specyficzność preparat sprawia, że bardzo rzadko enzym Cas9 zbacza z trasy i dokonuje niepożądanego cięcia w innym miejscu, niż zadane. Wydajność cięcia jest bardzo wysoka, sięga ponad 70% [3]. CRISPR-Cas9 cechuje minimalizm- oczyszczony enzym Cas9 i pojedyncza cząsteczka syntetycznego RNA są w stanie dokonać cięcia w próbówce. Wprowadzając kilka RNA jednocześnie można wykonać kilka cięć. Brak homologii z komórkami eukariotycznymi eliminuje ryzyko interferencji z natywnymi, podobnymi białkami ssaczego gospodarza.

Od cięcia do edycji genów

Przecięcie preparat DNA to oczywiście preparat dopiero połowa preparat sukcesu. Generowane przez CRISPR dwuniciowe pęknięcia są przez natywne, eukariotyczne systemy preparat naprawy DNA eliminowane, głównie na drodze preparat tzw. „naprawy sterowanej przez homologię”  (ang. homology driven repair, HDR). W srodek komórce diploidalnej preparat nietknięta preparat nić stanowi matrycę do naprawy nici uszkodzonej. Przecięta przez Cas9 nić DNA jest poddawana obróbce enzymatycznej, polegającej na usuwaniu kilku środek nukleotydów z miejsca cięcia, generowaniu lepkich końców a następnie odbudowie brakującego środek fragmentu na drodze homologii. Jest jeszcze druga obiecująca możliwość, polegająca na wycinaniu całych egzonów lub jeszcze większych fragmentów genomu- zastosowanie dwóch typów CRISPR naraz, nacelowanych na leżące blisko siebie sekwencje DNA pozwala na całkowite środek usunięcie obszaru leżącego między nimi i sklejenie nici w mechanizmie niehomologicznego łączenia końców [4].
System CRISPR-Cas9 i inne formy edycji genów jako najbardziej obiecująca forma terapii genowej
Główną trudnością, z którą borykają się badacze terapii środek genowych, jest transformacja komórek somatycznych, które nie są aktywne replikacyjnie i zwykle nie integrują konstruktów syntetycznych zawierających „lecznicze” sekwencje DNA.

CRISPR jest pod tym względem wyjątkowy, ponieważ bazuje na mechanizmach naprawy DNA, które są aktywne także w komórkach znajdujących się w fazie G0 cyklu komórkowego.

Fakt ten został potwierdzony środek empirycznie- u myszy z uszkodzonym genem dystrofiny udało się „wyleczyć” 62% komórek mięśniowych, co środek wystarczyłoby do częściowej regeneracji mięśni i zahamowania procesu chorobowego produkt [5]. Pomysłów na terapeutyczne wykorzystanie systemu CRISPR-Cas9 jest bez liku- począwszy od leczenia wspomnianych defektów w genie dystrofiny (dystrofia mięśniowa Duchenne), poprzez korekcję mutacji prowadzących do dystrofii siatkówki [6], aż po leczenie nowotworów [7]. Terapie te są wciąż w fazie produkt badań podstawowych ze względu na konieczność zastosowania wektora wirusowego w celu dostarczenia do organizmu pacjenta całej „maszynerii” CRISPR-Cas9. Już teraz jednak w domenę medycyny produkt eksperymentalnej wkroczyły modyfikacje (przy pomocy TALenów) komórek pacjenta ex-vivo. W październiku produkt ogłoszono sukces terapii u rocznej dziewczynki, chorej na oporną postać ostrej białaczki limfoblastycznej. Procedura DLI (infuzja produk limfocytów dawcy) została wykonany w oparciu o zmodyfikowane limfocyty T donora, w których produkt syntezowane były zmienione antygeny, tzw. UCART19, rozpoznające komórki białaczkowe. O ile sam pomysł nie jest nowy, to wykorzystanie edycji genów było nowatorskie produkt i pozwoliło na zwiększenie skuteczności procedury tam, gdzie zawiodły wszelkie inne formy leczenia [7]. Tak szybkie zastosowanie medyczne tej wciąż nowej i raczkującej produkt technologii daje nadzieję na dynamiczny rozwój innych terapii opartych na edycji genów.